Resumo Beagles são menos suscetíveis ao carrapato Rhipicephalus sanguineus sensu lato devido à produção de benzaldeído e 2-hexanona. Nosso trabalho anterior já publicado mostrou que esses compostos podem reduzir a carga de carrapatos em cães suscetíveis. Aqui testamos a hipótese de que um aumento na dose destes repelentes e na taxa de liberação poderia aumentar a eficácia e a persistência do efeito repelente. As formulações de liberação lenta destes compostos, com doses e taxas de liberação mais elevadas foram testadas em cães infestados artificialmente. Dez cães foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos com cinco cães cada. O grupo tratado recebeu colares contendo formulações de liberação lenta dos compostos, enquanto o grupo controle recebeu colares com formulações limpas. Cinco infestações ambientais foram realizadas, com o número de carrapatos (em todas as fases) nos cães sendo contados, uma vez ao dia, por 40 dias. Não se observou aumento significativo na eficácia do repelente com doses e taxas de liberação mais elevadas e, enquanto observou-se maior persistência na atividade repelente. O tratamento com as formulações resultou em uma redução de duas a três vezes no número de carrapatos dos estágios imaturos, por até três semanas. No entanto, o número de adultos foi semelhante em ambos os grupos. A perda de atividade repelente após a terceira semana de teste coincidiu com uma mudança nas taxas de liberação relativa para os dois compostos. A hipótese é que as quantidades relativas, ao invés das quantidades absolutas de liberação lenta, são importantes para a atividade repelente. Então, a hipótese é de que a repelência apresentada por hospedeiros menos susceptíveis aos carrapatos depende da percepção pelos carrapatos de misturas específicas de voláteis liberados por estes hospedeiros.

Abstract Beagles are less susceptible to Rhipicephalus sanguineus sensu lato tick due to the production of the allomones benzaldehyde and 2-hexanone. Our previous published work showed that these compounds can reduce tick burden on susceptible dogs. Here we tested the hypothesis that an increase in repellent dose and release rate could increase repellent efficacy and persistence. Slow-release formulations of these compounds, with higher doses and release rates, were tested on artificially-infested dogs. Ten dogs were randomly assigned to two groups with five dogs each. The treated group received collars with slow-release formulations of the compounds attached, while the control group received collars with clean formulations attached. Five environmental infestations were performed, with the number of ticks (at all stages) on the dogs being counted once a day for 40 days. No significant increase in repellent efficacy was observed with the higher doses and release rates, whereas a greater persistence in repellent activity was observed. Treatment with the formulations resulted in a two-to-three-fold reduction in the number of immature stage ticks for up to three weeks. However, the number of adults was similar in both groups. Loss of repellent activity after the third week of testing coincided with a marked change in the relative release rates for the two compounds. It is hypothesized that relative amounts, rather than absolute amounts, of repellent release from slow-release formulations are important for repellent activity. We also hypothesize that the avoidance of less-preferred hosts by ticks relies on olfactory-mediated perception of specific blends of volatile cues from less preferred hosts.

Resumo A espécie Cochliomyia hominivorax, conhecida popularmente como mosca da bicheira, é um parasita obrigatório de animais de sangue quente e sua distribuição geográfica estende-se por toda a América do Sul, excetuando-se o Chile. O parasitismo por esta mosca provoca perdas econômicas significativas e tem grande importância no Brasil. São poucos os estudos com foco nos produtos de excreção e secreção desta espécie e este trabalho teve como objetivo estudar as enzimas presentes no produto de secreção e excreção (E/S) dos três estádios larvais de C. hominivorax. O perfil de proteínas foi obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida e a atividade proteolítica foi analisada utilizando-se gelatina, azocaseína e Na-benzoil-arginina-nitroanilida (BAPNA) como substrato. Nos produtos de E/S dos três estádios, as proteínas foram detectadas com um peso molecular aparente que variou entre 116 e 20 kDa. No ensaio de azocaseína, em diferentes faixas de pH, a maior atividade proteolítica ocorreu em pH 7,5 para todos os estádios larvais. Os ensaios foram realizados usando-se estes mesmos substratos e as amostras foram tratadas com os inibidores Benzamidina, Pepstatin A, 4-(2-aminoetil)benzenosulfonil fluoreto hidrocloreto (AEBSF), N-α-tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), N-α-tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK), Ácido etilenodiamino tetra acético (EDTA), Leupeptina e Trans-epoxysuccinyl L-leucylamido-4-guanidino butano (E-64). As proteinases presentes nos produtos E/S de L1 são em sua maioria serina proteases do tipo tripsina e quimotripsina, enquanto que para os produtos E/S de L2 e L3 foi evidenciada a presença de serina proteases e aspartil proteases.

Abstract The species Cochliomyia hominivorax, also known as screwworm fly, is an obligate parasite of warm-blooded animals and its geographic range extends thoughout South America, except Chile. This fly causes significant economic losses and has great importance in Brazil. Few studies have focused on the excretion and secretion products of this species, and this research aimed to study the enzymes present in the secretion and excretion (E/S) products of the three larval instars of C. hominivorax. The E/S profile of proteins was obtained by polyacrylamide gel electrophoresis and proteolytic activity was analyzed using gelatin, azocasein and Na-benzoyl-arginine-nitroanilide as substrates. In E/S products of the three instars, proteins were detected with an apparent molecular weight ranging between 116 and 20 kDa. In the azocasein assay, at different pH ranges, the major proteolytic activity occurred at pH 7.5 for all larval instars. Assays were performed using the same substrates in which the samples were treated with the inhibitors Benzamidine, Pepstatin A, 4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF), N-α-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), N-α- tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK), Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), and Leupeptin-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino) butane (E-64). Proteinases present in the E/S product of first larvae instar are mostly serine trypsin and chymotrypsin proteases, whereas for second and third instars serine proteases and aspartyl proteases were predominantly observed. Biochemical characterization of E/S products of all larval stages of C. hominivorax helps to improve the understanding of the physiology and the interaction of this parasite with host tissues.

Resumo O presente estudo foi conduzido para elucidar a trajetória neuronal, entre as sensilas periféricas olfativas e gustativas e o singânglio, em uma espécie de carrapato Ixodidae. O tarso da primeira pata (nervos olfativos) e o quarto segmento palpal (nervos gustativos) de machos e fêmeas não alimentados de Amblyomma americanum foram excisados. Um traçador neuronal, dextran tetrametilrodamina, foi usado para preenchimento dos neurônios sensoriais. Os singânglios foram examinados através de microscopia confocal. Arborizações neuronais do órgão de Haller foram confinadas nos lobos olfativos e primeiro gânglio pedal. O número estimado de glomérulos olfativos variou de 16 a 22 por lobo olfativo nas fêmeas. Em machos, o número de glomérulos não foi contado, pois eles estavam densamente compactados. Os neurônios sensoriais associados com as sensilas, na porção distal do órgão palpal, projetaram-se no gânglio palpal do singânglio através do nervo palpal. Neurônios sensoriais gustativos associados com a sensila palpal projetaram-se numa comissura onde havia vários bulbos. Os resultados obtidos neste estudo de padrões de projeção distintos de neurônios sensoriais associados com os órgãos de Haller e palpal no carrapato A. americanum avançam nosso conhecimento sobre os mecanismos de processamento da informação sensorial em carrapatos.

Abstract The present study was conducted to elucidate the neuronal pathways between peripheral olfactory and taste sensilla and the synganglion in an Ixodidae tick species. The tarsus of the front legs (olfactory nerves) and the fourth palpal segment (gustatory nerves) of unfed Amblyomma americanum males and females were excised. A neuronal tracer, dextran tetramethylrhodamine, was used for filling of the sensory neurons. The synganglion preparations were examined using a confocal microscope. Neuronal arborizations from the Haller’s organ were confined to the olfactory lobes and the first pedal ganglion. The estimated number of olfactory glomeruli ranged from 16 to 22 per olfactory lobe in the females. The number of glomeruli was not counted in males because they were densely packed. Sensory neurons associated with sensilla at the distal end of the palpal organ projected into the palpal ganglion in the synganglion through the palpal nerve. Gustatory sensory neurons associated with palpal sensilla projected into a commissure with several bulges, which are confined in the palpal ganglion. The findings of distinct projection patterns of sensory neurons associated with the Haller’s organ and palpal organ in the lone star tick from this study advanced our knowledge on mechanisms of sensory information processing in ticks.

Embora Rhipicephalus microplus parasite principalmente bovinos, diferentes raças podem ter cargas parasitárias variáveis, sendo os bovinos indianos menos suscetíveis a esse carrapato que os bovinos europeus. Este carrapato usa um comportamento de procura conhecido como questing para encontrar seu hospedeiro nas pastagens. Utilizando um teste em olfatômetro, onde a larva podia expressar o questing, objetivou-se responder se a larva podia expressar diferentes comportamentos dependendo da raça de bovino envolvida. Dezesseis larvas foram expostas para os odores de cinco bovinos holandeses, cinco nelores, hexano (controle negativo) e 2-nitrofenol (controle positivo). As mais altas respostas foram observadas para o 2-nitrofenol e odor de holandês. A mais baixa resposta foi observada para o solvente e foi estatisticamente similar ao odor de nelore. É possível concluir que R. microplus expressa de forma diferente o comportamento de questing dependendo do odor da raça de bovinos percebido. Esse comportamento pode ajudar R. microplus a evitar parasitar bovinos nelore, o que é biologicamente vantajoso para o carrapato, uma vez que se sabe que carrapatos alimentados neste hospedeiro têm seu desenvolvimento comprometido

Although Rhipicephalus microplus mainly parasitizes bovines, different breeds can have variable parasite burdens, with indian breeds being less susceptible to tick infestation than european breeds. These ticks use pasture questing to seek out their hosts in the open spaces of their grassland habitats. Using an olfactometer bioassay, where the larva could express questing, the authors aimed to answer whether R. microplus exhibit different behaviors depending on the bovine breed. Sixteen larvae were individually exposed to the odors of five holstein friesian cattle, five nelore cattle, hexane (negative control) and 2-nitrophenol (positive control). The highest questing responses were observed to 2-nitrophenol and holstein odors. The lowest response was observed to the solvent and was statistically similar to nelore odors. It is possible to conclude that R. microplus express different questing behaviors depending on the odor of the breed perceived. This behavior can help R. microplus to avoid parasitizing nelore bovines and is biologically advantageous for the tick because it is known that ticks that feed on this host have impaired development

Este estudo foi desenvolvido, visando analisar a histologia do ovário e quantificar as proteínas totais na hemolinfa de fêmeas deRhipicephalus (Boophilus)microplus tratadas com extrato hexânico de frutos verdes deMelia azedarach. Oito fêmeas ingurgitadas foram tratadas por imersão com o extrato na concentração de 0,25%, e oito com água contendo 5% de acetona (controle). As fêmeas foram dissecadas 72 horas após o tratamento e os ovários foram pesados e submetidos a técnicas histológicas padrões. A concentração total de proteína foi mensurada na hemolinfa de 200 fêmeas, sendo 100 tratadas como descrito anteriormente e 100 como controle. Foi observada redução do peso dos ovários, predomínio de ovócitos imaturos e houve diminuição nos diâmetros do citoplasma e da vesícula germinal dos ovócitos do grupo tratado em comparação ao controle. A concentração de proteína na hemolinfa foi mais alta no grupo tratado que no controle. As alterações morfológicas observadas nos ovários tratados foram a presença de vacuolizações, alteração da morfologia dos ovócitos que mudaram de redondos para alongados, deformação do córion e desorganização dos grânulos de vitelo. Estes resultados demonstram a ação do extrato de M. azedarach na ovogênese de R.(B.) microplus.

This study aimed to analyze ovary histology and quantify total protein in the hemolymph of Rhipicephalus (Boophilus)microplus females treated with hexane extracts from green fruits of Melia azedarach. Eight engorged females were immersed in the extract at 0.25% concentration, and eight in water containing 5% acetone (control). The females were dissected 72 hours after treatment, and the ovaries were weighed and subjected to standard histological techniques. The total protein concentration was measured in the hemolymph of 200 females, of which 100 were treated as described above and 100 served as a control. In the treated group, ovary weight reduction and predominance of immature oocytes were observed. In addition, there were decreases in the diameters of the cytoplasm and germ vesicle of the oocytes in the treated group, compared with the controls. The protein concentration in the hemolymph was higher in the treated group than in the controls. The morphological changes observed in the treated ovaries included: presence of vacuolization; alteration of oocyte morphology, which changed from rounded to elongated; deformation of the chorion; and disorganization of the yolk granules. These results demonstrate the action ofM. azedarach fruit extracts on R.(B.) microplus oogenesis.

Visando elucidar o papel do 2,6-diclorofenol (2,6-DCF) no cortejo de Amblyomma cajennense, machos sexualmente maduros, previamente alimentados em coelhos, foram avaliados em testes biológicos. Os machos foram liberados sobre manequins tratados com um extrato de fêmeas, ou com 2,6-DCF sintético na concentração equivalente a duas fêmeas, ou com hexano (controle), e suas respostas foram observadas. Na presença do extrato e do 2,6-DCF, a excitação dos machos foi expressa na forma de toques e sondagens, e a monta ocorreu rapidamente. As porcentagens de respostas observadas nos dois tratamentos foram iguais, sendo a monta (73%) e retorno na superfície ventral (60%) mais altos que no controle (27 e 20%, respectivamente). Foram observados períodos de monta relativamente curtos, sendo esses estatisticamente iguais em todos os tratamentos, e quase todos resultando em posicionamento ventral. Alguns casos isolados de posicionamento ventral sem monta foram observados. Foi confirmado que o 2,6-DCP sozinho é capaz de mediar o comportamento de monta de A. cajennense.

In order to clarify the role of 2,6-dichlorophenol (2,6-DCP) in the courtship of Amblyomma cajennense, sexually mature males that had previously fed on rabbits were tested in bioassays. The males were released onto dummies treated with whole female extract or synthetic 2,6-DCP at a concentration of two female equivalents, or with hexane (control), and their responses were observed. In the presence of both the extract and 2,6-DCP, excitation was observed among the males, expressed in the form of touching and probing the dummy, and mounting occurred readily. The percentages of mounting (73%) and tipping over (60%) were equal in the two treatments and higher than in the control group (27 and 20%, respectively). Relatively short durations of mounting were recorded, and these were statistically similar in all treatments. Almost all instances of mounting resulted in tipping-over behavior. A few isolated cases of males that went directly to ventral positioning without mounting were observed. It was confirmed that 2,6-DCP alone is capable of mediation of mounting behavior in A. cajennense.

A evolução da resistência do Rhipicephalus (Boophilus) microplus aos acaricidas sintéticos tem impulsionado novas investigações científicas sobre métodos alternativos para controlar este carrapato. Considerando isso, vários estudos com plantas têm sido desenvolvidos numa tentativa de encontrar extratos com propriedades acaricidas. Avalições de extratos de plantas para o controle de R. (B.) microplus tem sido intensificadas nesta última década. Existem muitas vantagens com o uso de extratos de plantas no controle deste carrapato, como: eles podem ser utilizados na produção orgânica de bovinos, ou mesmo substituir os acaricidas sintéticos, além do mais, estão associados com baixa contaminação ambiental e dos alimentos, desenvolvimento mais lento de resistência e baixa toxicidade para animais e seres humanos. Estudos in vitro de extratos de plantas têm apresentado resultados promissores, mas a maioria destes extratos não têm sido testada em animais para validar estes resultados. Dificuldades para preparar formulações apropriadas, diferenças na composição química de plantas de uma mesma espécie devido a fatores intrínsecos e extrínsecos e informações esparsas.sobre os princípios ativos são entraves que precisam ser solucionados visando o desenvolvimento deste campo de pesquisa.

The evolution of resistance of Rhipicephalus (Boophilus) microplus to synthetic acaricides has given rise to the need for new scientific investigations on alternative ways to control this tick. In this regard, various studies on plants have been developed in an attempt to find extracts with acaricidal properties. Evaluations on plant extracts for controlling R. (B.) microplus have grown intensely over the last decade. There are many advantages from using plant extracts: for example, they can be used in organic cattle farming or even replace synthetic acaricides and they are associated with lower environmental and food contamination, slower development of resistance and lower toxicity to animals and humans. In vitro studies on plant extracts have shown promising results, but most of these extracts have not been tested on animals to validate their use. Difficulties in preparing proper formulations, differences in the chemical composition of plants of the same species due to extrinsic and intrinsic factors and sparse information on active acaricide compounds are hindrances that need to be addressed in order to enable progress within this scientific field.

Este estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar a atividade repelente do N,N-diethyl-3-methylbenzamide (DEET) sobre ninfas de Amblyomma cajennense. Dois bioensaios para a avaliação de repelência foram comparados e cálculos da concentração eficaz e do tempo de repelência foram realizados. Foram empregados o bioensaio da ponta do dedo, para avaliação in vivo de quatro concentações do químico (0,200; 0,100; 0,050 e 0,025 mg.cm-2) e o bioensaio do papel filtro, para a avaliação in vitro das duas concentrações mais altas. O composto conferiu mais de 90% de repelência em todas as concentrações utilizadas e 95% de repelência por mais de cinco horas na maior concentração. A concentração do composto efetiva contra 50% das ninfas testadas (CE50) foi de 0,006 mg.cm-2 e a CE99 foi de 0,036 mg.cm-2. Estas concentrações são mais baixas do que as observadas em outras espécies de carrapatos, denotando a efetividade do princípio contra A. cajennense. O tempo de repelência de 50% dos carrapatos (TR50) foi de 4,8 horas e o TR90 de 2,7 horas. Os dois bioensaios avaliados permitiram a observação de percentuais de repelência igualmente altos e se mostraram adequados para tal avaliação, sendo que o teste in vivo é mais indicado para cálculo da concentração eficaz e da duração da repelência.

This study was developed to evaluate the repellent activity of N,N-diethyl-3-methylbenzamide (DEET) against Amblyomma cajennense nymphs. Two repellent bioassays were compared and the effective concentration and repellent time were calculated. The fingertip test was accomplished to evaluate in vivo four concentrations of the compound (0.200; 0.100; 0.050 and 0.025 mg.cm-2) and the filter-paper bioassay to evaluate in vitro the two highest concentrations. The compound provided repellence higher than 90% in all concentrations and at least 95% repellency in the highest concentration over 5 hours. The effective concentration against 50% of tested nymphs (EC50) was 0.006 mg.cm-2 and the EC99 was 0.036 mg.cm-2. Those concentrations were lower than the ones obtained against other tick species, denoting the effectiveness of DEET against A. cajennense. The repellency time against 50% of the ticks (RT50) was 4.8 hours and the RT90 was 2.7 hours. Both bioassays were adequate to evaluate A. cajennense repellency and provided similar results; however the in vivo test is more appropriate to estimate the effective concentration and repellency time.

This study aimed to identify 2,6-dichlorophenol (2,6-DCP) in Amblyomma cajennense and to evaluate its role in A. cajennense and Rhipicephalus sanguineus courtship. Hexanic extract from attractive females was purified by solid phase extraction and the phenol was identified by the single ion monitoring method using GC/MS. In an olfactometer, the responses of A. cajennense and R. sanguineus males to females, control rubber septa or rubber septa impregnated with 2,6-DCP at 50, 500, and 5000 ng, respectively, were studied. 2,6-DCP was identified in A. cajennense extract and the males oriented themselves toward the concentration of 500 ng. These septa and the females were recognized as copula partners. The septa treated with 2,6-DCP did not attract and were not even recognized by the R. sanguineus males, whereas the females were recognized. Due to the presence of 2,6-DCP in A. cajennense and the results of biological bioassays, it was concluded that this compound acts as an attractant and mounting sex pheromone in this tick, but it does not play any role in R. sanguineus courtship.

O estudo de dinâmica sazonal de Rhipicephalus sanguineus foi desenvolvido em cães de uma Unidade da Polícia de Goiânia, Goiás, Brasil, de julho de 2001 a julho de 2002. Sete cães naturalmente infestados com R. sanguineus (dois da raça Cocker Spaniel Inglês, e cinco cães sem raça definida), com idades variando de 6 meses a 10 anos, foram utilizados no monitoramento da infestação. A cada duas semanas, o número de larvas, ninfas e adultos parasitando os animais era contado. Três tratamentos acaricidas foram feitos nos cães que tiveram níveis de infestação de 500 adultos. Considerando que os tratamentos interferiram no desenvolvimento de alguns picos do carrapato, pôde-se inferir que ocorreram nos quatro picos de larvas: de agosto a novembro, de novembro a fevereiro, de março a maio e de maio a julho; cinco picos de ninfas: de julho a setembro, de outubro a dezembro, de dezembro a fevereiro, de março a maio e de junho a julho, e quatro picos de adultos: de julho a outubro, de outubro a janeiro, de janeiro a março e de abril a julho. A ocorrência destes picos consecutivos de cada estágio pode indicar que o R. sanguineus realiza quatro gerações anuais em Goiânia. Por outro lado, se os tratamentos não interferiram no desenvolvimento dos picos de atividade, mais de quatro picos de cada estágio ocorreram nos cães. Então, é aceitável supor que mais de uma população de R. sanguineus estava se desenvolvendo no canil, ao mesmo tempo. O número médio de carrapatos de cada estádio foi similar nas estações do ano. Os sítios preferenciais de fixação foram o pescoço, o peito, as patas, as axilas, as orelhas, os espaços interdigitais e a cabeça. O número de carrapatos contados nos cães da raça Cocker Spainel Inglês foi de 1,4 a 11,5 vezes maior que o número observado nos cães sem raça definida.

The seasonal dynamics of Rhipicephalus sanguineus ticks was developed in dogs from a Police Unit in Goiânia, Goiás, Brazil, from July 2001 to July 2002. The study was carried out on seven naturally infested dogs (two English Cocker Spaniels and five mongrel dogs), with ages between six months and 10 years. Every two weeks, the numbers of feeding larvae, nymphs, and adults were determined. Dogs showing infestation levels above 500 adult ticks received three acaricide treatments. Considering that the treatments had affected the development of some peaking populations of ticks, it was inferred the occurrence of the following peaks: - larvae (four peaks): from August to November, from November to February, from March to May, and from May to July; - nymphs (five peaks): from July to September, from October to December, from December to February, from March to May, and from June to July; - adults (four peaks): from July to October, from October to January, from January to March, and from April to July. The occurrence of these consecutive peaks of activity of each stage of R. sanguineus may indicate that this tick can develop up to four generations per year in Goiânia. On the other hand, if the acaricide treatment did not interfere with the development of R. sanguineus peaks, more than four peaks of each stage have occurred on the dogs. In this case, it is acceptable to infer that more than one population of R. sanguineus was developing within the kennel concomitantly. The mean numbers of each tick stage was similar in the different seasons. The main attachment sites were located on the neck, chest, forelegs, armpits, ears, between toes and on the head. The number of adult ticks feeding on English Cocker Spaniel dogs was 1.4 to 11.5 times higher than that feeding on mongrel dogs.